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一、PCR操作范例
在一個典型的pcr反應(yīng)體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2+和兩個合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min，引物與模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循環(huán)前模板預(yù)變性3～5min；在末次循環(huán)后，樣品仍需繼續(xù)延伸3～5min以上，確保擴(kuò)增的DNA為雙鏈DNA。為便于了解PCR反應(yīng)中各成份的組成，加入量和反應(yīng)條件，使人們以此為基礎(chǔ)，對不同的研究對象逐項改變來找到最佳反應(yīng)條件，特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應(yīng)條件供參考。

表22-1 PCR反應(yīng)混合液

成分

加入體積（μl）

最終濃度

雙蒸餾水

53.5

10×反應(yīng)緩沖液[1]

10.0

[1×]Mg2+1.5mmol/l K+50mmol/L

4×dNTPs(各1.25mmol/L)

16.0

各200μmol/L

λ-DNA模板（全長48.5kD）

10.0

1ng/次

引物1,2（各25bp,20μmol/L）[3,4]

5.0

1.0μmol/L（100pmol）

Taq聚合酶儲存液[2]

0.5

2U/100μl

總體積（pH8.3）

100.0

石蠟油

50～100.0

擴(kuò)增條件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30個循環(huán)。

注：[1]反應(yīng)緩沖液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2,

0.01%(W/V)明膠（Sigma G2500）

[2]酶儲存緩沖液（-20℃）含：50%甘油，100mmol/l KCl,

20mmol/L Tris-HCl ph8.0

0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

200μg/ml明膠

0.5%吐溫20，0.5% Nonidet P40

[3][4]引物，1，2：擴(kuò)增λ-噬菌體基因中500bp的片段

引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

注意（3’）端有2個bp互補(bǔ)故易生成50bp的雙體

二、PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成

（一）PCR緩沖液（PCr Buffer）

用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液見PCR操作范例。于72℃時，反應(yīng)體系的pH值將下降1個單位，接近于7.2。二價陽離子的存在至關(guān)重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實驗表明，Mg2+優(yōu)于Mn2+，而Ca2+無任何作用。

1．Mg2+濃度Mg2+的最佳濃度為1.5mmol/L(當(dāng)各種dNTP濃度為200mmol/L時)，但并非對任何一種模板與引物的結(jié)合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結(jié)合時，都要把Mg2+濃度調(diào)到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg2+過量易生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，Mg2+不足易使產(chǎn)量降低。