紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量原理是為了學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。掌握TU-1901紫外可見分光光度計(jì)的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。
紫外可見分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)原理是以溶液中物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外和可見光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外光：10-400 nm，可見光：400-780 nm(可被人們的眼睛所感覺)，特點(diǎn)：帶光譜、分子光譜。
實(shí)驗(yàn)步驟
一，啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動(dòng)工作站并初始化儀器,預(yù)熱半小時(shí)。用吸量管分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比(參比溶液不可取出)。在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目為光譜掃描，設(shè)置掃描參數(shù)(起點(diǎn)：400nm，終點(diǎn)：250nm，速度：中，間隔：1.0nm，單次掃描)。將兩個(gè)均裝有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入測(cè)量池中，進(jìn)行基線掃描，然后選定量測(cè)定，校零，在調(diào)回光譜掃描。
二，吸收曲線的制作:(找出最大吸收波長(zhǎng))；將放在前面的比色皿中溶液換為0.3 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，點(diǎn)擊START進(jìn)行掃描，得到如下吸收曲線，從曲線中我們可以看出此標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的最大吸收波長(zhǎng)為278nm，此波長(zhǎng)下的吸光度為0.1984。
三，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目為光度測(cè)量設(shè)置測(cè)量條件(測(cè)量波長(zhǎng)：278.00 nm)。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在278nm處分別測(cè)定以上所配標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：
四，樣品測(cè)定；配制三份待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，(取待測(cè)蛋白質(zhì)溶液2.0mL分別于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度)按上述方法測(cè)定278 nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906，0.3765，0.3848。平均值為A278=0.3840,根據(jù)樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度為0.6101mg/mL。轉(zhuǎn)換后待測(cè)蛋白質(zhì)溶液的濃度為C= 0.6101mg/mL ?10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。
五，注意事項(xiàng)；準(zhǔn)備工作：在測(cè)量前應(yīng)把機(jī)器預(yù)熱半小時(shí)。溶液一定要配制準(zhǔn)確,以防影響實(shí)驗(yàn)效果,保證點(diǎn)在一條直線上。由于蛋白質(zhì)的紫外吸收峰常因PH值的改變而改變，故進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)的PH最好與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的PH值一致。測(cè)量工作：吸收曲線繪制前必須進(jìn)行光譜的掃描。在作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量前一定要選擇最大的吸收波長(zhǎng),確保靈敏度高。在實(shí)際操作中，比色皿在使用中應(yīng)注意保持干凈，更不能觸摸比色皿的光面，以防摩擦影響通光。
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